不同血管段活性差異對(duì)葛根素血管舒張作用機(jī)制的影響

　　摘要：研究離體血管環(huán)試驗(yàn)中不同血管段活性差異對(duì)葛根素(Puerarin，Pue)的舒張作用差異并探討其機(jī)制。方法：SD大鼠36只，常規(guī)方法制備離體血管環(huán)標(biāo)本，分為內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮組兩大組，其中每組都設(shè)有遠(yuǎn)心段、中段和近心段三組。用離體血管灌流大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，血管基礎(chǔ)張力定為9.8×10-3 N(1 g)，測定各組血管環(huán)張力及葛根素pEC50。內(nèi)皮完整組分別加入L-NAME與葛根素(浴槽終濃度為10-4 mol•L-1)共同孵育，測定血管環(huán)張力變化，并計(jì)算pEC50。結(jié)果：葛根素在10-7～10-4 mol•L-1范圍內(nèi)對(duì)腹主動(dòng)脈具有劑量依賴性的舒血管效應(yīng)，在10-4 mol•L-1達(dá)到(61.2±3.7)%的最大舒張;去內(nèi)皮后其舒血管效應(yīng)可降低(34.6±6.1)%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);遠(yuǎn)心段去內(nèi)皮及內(nèi)皮完整血管環(huán)Emax均較近心段和中段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);內(nèi)皮完整遠(yuǎn)心段組中，葛根素與L-硝基精氨酸(L-NAME)共同孵育后，Emax顯著下降(P<0.05);而近心段和中段組中，L-NAME與葛根素共同孵育組血管舒張的受抑制程度與葛根素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組pEC50比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：葛根素具有內(nèi)皮依賴性的舒血管效應(yīng)，但不同血管段中舒張活性存在差異，該作用與NO系統(tǒng)有關(guān)。

　　關(guān)鍵詞：葛根素;胸主動(dòng)脈環(huán);NO合成酶;血管舒張

　　葛根素(Puerarin，Pue)具有擴(kuò)血管、降血壓、抗心肌缺血等作用。以往研究表明葛根素?cái)U(kuò)血管機(jī)制存在爭議，可能與實(shí)驗(yàn)條件和動(dòng)物種屬不同有關(guān)。本文的研究旨針對(duì)血管條的不同血管段血管活性不同對(duì)于葛根素血管舒張作用機(jī)制的影響，應(yīng)用NO合酶抑制劑L-硝基精氨酸(L-NAME)，探討葛根素對(duì)不同胸主動(dòng)脈段的舒張作用與NO的關(guān)系，觀察葛根素的舒血管作用機(jī)制。

　　1 資料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠36只，體重250～300 g，雌雄兼用，由青龍山動(dòng)物中心提供。

　　1.1.2 藥品：重酒石酸去甲腎上腺素(Noradrenaline Bitartrate，NA)購自天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：0803192;苯腎上腺素(Phe)，L-硝基精氨酸(L-NAME)購自Fluka，批號(hào)：1115878、40705093;氯化乙酰膽堿(Ach)購自Alfa Aesar公司，批號(hào)：10132497;葛根素，由南京師范大學(xué)袁生教授實(shí)驗(yàn)室提供;溶于50%丙二醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　1.1.3 試劑：K-H液：NaCl 118.0 mM，KCl 4.7 mM，NaHCO3 25.0 mM，KH2PO4 1.2 mM，MgSO4 1.2 mM，CaCl2 2.5 mM，glucose 11.0 mM。均為普通國產(chǎn)分析純。

　　1.1.4 儀器：MD 2 000生物信號(hào)采集系統(tǒng)購自南京醫(yī)科大學(xué)。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 不同種屬動(dòng)物胸主動(dòng)脈環(huán)制備：20%烏拉坦(給藥計(jì)量1 g/kg)麻醉，給藥量為0.6 ml/100 g。取正常大鼠胸主動(dòng)脈，置于預(yù)冷以100% O2飽和的K-H液中，去除血管周圍結(jié)締組織，制備成3～4 mm的血管環(huán)，并懸掛于盛有預(yù)先以95% CO2混合氣體的K-H液的5 ml浴皿中，下段用鋼絲鉤固定住，上段與張力換能器相連，用MD 2 000生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄張力Emax。浴皿中持續(xù)通入氣體，保持(37±0.5)的恒溫，給予不同前負(fù)荷，15 min換1次緩沖液，平衡60 min，加入NA(浴槽終濃度10-6 mol·L-1)預(yù)收縮2次，用K-H液洗脫至基線后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。去內(nèi)皮組以機(jī)械法去除內(nèi)皮。血管內(nèi)皮活性的檢驗(yàn)：用Phe(浴槽終濃度10-6 mol·L-1)處理動(dòng)脈環(huán)使其收縮至平臺(tái)，加入Ach(浴槽終濃度10-5 mol·L-1)動(dòng)脈環(huán)舒張至平臺(tái)，檢驗(yàn)內(nèi)皮完整性，舒張活性>70%為內(nèi)皮完整;舒張活性<20%則認(rèn)為內(nèi)皮去除。

　　1.2.2 葛根素對(duì)苯腎上腺素引起的收縮的影響：隨機(jī)選取大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，分為去內(nèi)皮組、內(nèi)皮完整組、溶劑對(duì)照及正常對(duì)照組，葛根素用Phe(浴槽終濃度10-6 mol·L-1)處理動(dòng)脈環(huán)使其收縮至平臺(tái)，加入葛根素(浴槽終濃度10-7～10-4 mol·L-1)動(dòng)脈環(huán)舒張至平臺(tái)，記算舒張百分?jǐn)?shù)。

　　1.2.3 胸主動(dòng)脈環(huán)的區(qū)域差異性：將大鼠的胸主動(dòng)脈從近心段開始剪成6段，編號(hào)1～6，取1、3、6分為作為近心段、中段和遠(yuǎn)心段，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[1]。分為去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組。兩組動(dòng)脈環(huán)分別經(jīng)預(yù)處理后，使溶液中累加苯腎上腺素的濃度依次(10-9～10-5 mol·L-1)，測定Phe引起大鼠胸主動(dòng)脈條收縮的改變。后用K-H液洗3次，待主動(dòng)脈條張力恢復(fù)正常并平衡45 min后，加入，孵育20 min后重復(fù)以上過程;或用L-NAME(浴槽終濃度10μmol·L-1)和葛根素(引起最大舒張百分?jǐn)?shù)的濃度)共同孵育20 min后，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　葛根素最大舒張濃度：結(jié)果如圖1所示，葛根素引起最大舒張的濃度為10-4 mol·L-1，去內(nèi)皮組和內(nèi)皮完整組的最大舒張百分?jǐn)?shù)為(40.2±7.78)%和(61.2±3.87)%，與溶劑及正常對(duì)照組相比，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);葛根素對(duì)去內(nèi)皮組與內(nèi)皮完整組的舒張作用比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，去內(nèi)皮組明顯舒張作用下降;溶劑與正常對(duì)照組相比，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明其對(duì)體外血管環(huán)無影響。

　　3 討論

　　體外血管環(huán)實(shí)驗(yàn)作為篩選心血管活性化合物及研究心血管活性物質(zhì)的作用機(jī)制常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用，但同時(shí)由于不同種屬動(dòng)物不同部位的血管作用仍存在差異，并且操作規(guī)范因人而異，從而相同化合物可能得到不同結(jié)果。而葛根素舒張血管作用機(jī)制在國內(nèi)外文獻(xiàn)中就大不相同。本文著重研究了體外血管環(huán)試驗(yàn)中容易被忽略的因素，即遠(yuǎn)心段、中段與近心段的血管環(huán)活性差異。

　　早在上世紀(jì)80年代，Kita T等[2]在研究中就發(fā)現(xiàn)在家兔家族性高膽固醇血癥模型中，遠(yuǎn)段胸主動(dòng)脈的血管損傷程度要比其他段血管嚴(yán)重許多。而在Honda H等[1]研究中，則發(fā)現(xiàn)中段和遠(yuǎn)心段血管較近心段血管舒張作用的不同與乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮源性NO的釋放有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中遠(yuǎn)心段血管環(huán)對(duì)于異丙腎上腺素誘導(dǎo)的血管收縮活性以及葛根素誘導(dǎo)的血管舒張作用活性較中段和近心段血管環(huán)弱。而葛根素于L-NAME孵育后乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張作用均減弱，但對(duì)于遠(yuǎn)心段血管環(huán)作用最強(qiáng)，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制可能與不同血管段合成NO能力不同有關(guān)。而中段和近心段血管在葛根素和L-NAME共同孵育后Emax雖升高，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中葛根素的舒血管作用機(jī)制的爭議可能與血管環(huán)樣本的選擇有關(guān)。但遠(yuǎn)心段血管環(huán)與中段、近心段血管環(huán)活性差異的進(jìn)一步機(jī)制仍值得深入研究。