多酚氧化酶的研究現狀

　　論文摘要：多酚氧化酶被認為是導致酶促褐變反應的主要因素，對其的研究也在逐步深入。文章結合多酚氧化酶的結構特性、催化機理、活性影響因素、生理功能、活性測定和分離純化等方面的內容，對多酚氧化酶的研究現狀進行了綜述。

　　論文關鍵詞：多酚氧化酶(PPO);催化機理;生理功能

　　多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO)屬核編碼含銅金屬酶，廣泛存在于植物、真菌、昆蟲等機體中。它可分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶、漆酶等三大類，由于其能有效催化多酚類化合物氧化形成相應的醌類物質，因此被認為是導致酶促褐變反應的主要因素。早在1937年Kubowitz就在Warburg實驗室中第一次分離得到了多酚氧化酶[2，3]。隨著研究的不斷深入，對多酚氧化酶各方面的認識也在不斷加深，本文就多酚氧化酶的結構特性、催化機理、生理作用等方面做簡要的介紹。

　　一、多酚氧化酶PPO的結構特性

　　PPO是一種含有Cu2+離子的結構蛋白，可以催化酚類上的羥基，使之轉化為醌或催化多酚類變?yōu)檠鹾?a target="_blank" title="醌">醌。因為醌類具有較強的電化學性質，會發(fā)生自動氧化、蛋白質的親核聚合反應及一些二級反應，而這些反應都會導致酶促褐變反應的發(fā)生。植物中的PPO包括一些由核編碼的，多基因的家族。在蕃茄中，已有幾個PPO的基因被分離出來，并從結構上將其分為三組。在馬鈴薯中，有4條獨立的cDNA被克隆，每一個都顯示了獨特的空間圖景。在扁豆中，有三條與PPO有關的cDNA克隆已被建立。所有的PPO基因都有兩個區(qū)域，一是與Cu有關的編碼區(qū)，另一個是引導肽(transitpeptide)，以便能進入質體。PPO的前體(含有引導肽的)約60-75KDa，而成熟的PPO(去除了引導肽的有活性的形式)約45-69 KDa，由于這種潛在的酶活性的存在，使PPO活性的問題研究起來十分復雜。未激活的PPO可被陳化作用、加鹽、去污劑(如SDS)、蛋白酶切或尿素的加入等激活。

　　二、PPO的催化機理

　　多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)是從真菌到植物乃至哺乳動物體內都廣泛存在的一類銅蛋白，它能有效催化多酚類化合物氧化形成相應的醒類物質。在茶兒茶素氧化PPO底物兒茶素(catechin)類能和許多金屬離子絡合，Cu2+離子形成的配位物中的配位數為4或6，可以從配位體的配位鍵來闡明PPO的催化生化機理。PPO的多肽鏈通過自身的折疊卷曲，形成具有一定構象的高級結構。Cu2+與多肽鏈上的氨基酸殘基以配位鍵相連，主要有His-His和Cys-His殘基作為銅離子的配基，形成具有特定立體結構的活性部位。當鄰苯二酚基和底物存在時，由于其“靠近”及“定向”效應，使多肽鏈和底物的空間構象發(fā)生改變，相互契合，從而使底物進入活性中心，鄰苯二酚基上的二個羥基與多肽鏈上的氨基酸殘基以氫鍵相連，形成酶與底物的復合物，由于復合物的不穩(wěn)定性，多肽鏈構象發(fā)生扭曲，氫鍵斷裂，H被附著在多肽鏈上，酶與底物不再契合，兩者都同時發(fā)生構象轉變，于是產物脫離了活性部位，成為鄰醌。鄰醌可發(fā)生一系列次生氧化作用，形成了多種氧化產物。酶又通過脫氫作用，發(fā)生構象回轉，恢復以前的天然構象，重新成為具有催化能力的蛋白質。

　　三、PPO的生理功能

　　高等植物組織發(fā)生褐變主要是PPO活動的結果。PPO催化單酚羥基化為鄰二酚，二羥酚氧化為鄰醌。醌聚合并與細胞內蛋白質的氨基酸反應，結果發(fā)生黑色或褐色色素沉淀，最終導致水果、蔬菜等經濟作物營養(yǎng)丟失和經濟損失。

　　PPO作為一種氧化還原酶還在光合作用中發(fā)揮作用。如調節(jié)葉綠體中有害的光氧化反應速度，參與其中電子傳遞;PPO還可促進傷口的愈合，也可增加植物對病原體的抗性。如煙草對炭疽病、黃瓜對黑星病、蘋果對輪紋病、棉苗對枯萎病菌、水稻對白葉枯病菌和細菌性條斑病以及番茄對小昆蟲的抗性等。PPO的作用方式有：

　　1.如番茄的具腺毛狀體中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化態(tài)和可溶性的特性，在毛狀體介導的抗病過程中起作用[12]。

　　2.通過醌共價調節(jié)親核氨基酸形成抗營養(yǎng)機制，直接抵御昆蟲和病原體[13]。

　　3.醌的毒性直接發(fā)揮抗病作用。

　　4.如番茄中PPO克隆的反義表達可對基因家族的各成員進行負調節(jié)，對病原體產生超敏感性(感受性過敏)[14]。

　　5.鄰醌的次生反應所產生的黑色素的痂可阻止感染的擴散[15]。

　　PPO與水果和作物的褐變有關，為了防止水果褐變保持水果的新鮮性，生產上運用多種方法來降低水果中的PPO含量，例如涂以抗壞血酸、檸檬酸為主劑的復合護色劑，杏用沸水燙4min基本控制PPO活性，對萊陽梨進行套袋抑制PPO活性等。

　　四、PPO活性影響因素

　　隨著誘導劑特性的不同，PPO的分子特性如分子量、等電點等都有所改變。生長培養(yǎng)基的成分也可部分地控制PPO酶產量，例如：硫酸銨抑制PPO形成，而谷氨酸促進PPO形成。在植物組織中激活劑可打破PPO的潛伏狀態(tài)。在蠶豆中PPO可被游離脂肪酸酸化激活，菠菜類囊體中分離出來的PPO可被亞麻酸激活。這表明PPO的天然激活劑確實存在。同樣PPO的天然抑制劑也存在，例如菠菜葉中的草酸鹽，茶葉中的橡黃素、白花青素等。礦物質營養(yǎng)例如鈣或磷的缺乏可導致PPO活性的降低;硼缺乏對單子葉植物無影響，但可導致雙子葉植物中PPO活性的增加。植物正常新陳代謝受到干擾也會導致PPO活性的改變：例如貯存時通風不好或生長時水分不夠均可引起PPO水平的升高。銅是PPO的組成部分，銅缺失時苜蓿葉片不能表現出PPO酶活性，即使后來再補充銅也不行，這說明全酶只能在發(fā)育的早期形成。

　　鐘瑾等[16]用自制殼聚糖與戊二醛交聯對PPO固定化進行了初步探討，表明當戊二醛濃度為2%時，酶活力最高，并提出在確定給酶量時，要兼顧酶活和回收率二者的影響以達到最佳。李榮林等[17]應用海藻酸鈉和戊二醛交聯法對PPO進行包埋取得了成功，并對其性質進行了系統(tǒng)研究發(fā)現[18]：將酶的最適pH上移至7.0，最適溫度上升至40℃，酶對金屬離子的適應性增強，對抑制劑敏感性下降，低溫貯存下，半衰期由3個月上升到221天。

　　五、PPO活性的測定方法

　　測定多酚氧化酶活性的方法有：檢壓法、極譜電極法、比色法、碘量滴定法等[19]。最早是將酚或鄰苯二酚作為底物用滴定法來測定多酚氧化酶活性，后來發(fā)現用極譜電極法測定O2消耗更精確一些[20]。但是，無論是滴定法還是極譜電極法都必須經過種子研磨的過程，為了測定的省時方便， Kruger[21]首創(chuàng)了無須研磨種子就可以測出小麥多酚氧化酶活性的方法:種子在水中浸泡16h，然后加入鄰苯二酚，反應30min后用動態(tài)的微盤計數器測溶液的顏色變化。將這種方法與研磨種子氧電極法比較，相關系數為0. 85。伴隨著科技的發(fā)展和分光光度計的應用， Anderson[22]將整粒種子測定方法做了進一步改進: 3～5個整籽�；�0.4g被鉗碎的種子放入離心管中，加入用50mM MOPS緩沖液配制的L-DO-PA，室溫振蕩反應30min或37℃振搖5min后過濾，然后在分光光度計下測定475nm吸收值，這種方法與研磨種子氧電極法比較，相關系數為0.86。

　　六、PPO的分離純化

　　PPO通常以不溶狀態(tài)存在，為使其以可溶形式從完整細胞或組織結構中釋放出來，并保持其活性和穩(wěn)定性，通常要進行充分的細胞破碎，釋放出細胞的內含物，經勻漿提取后可得粗酶制劑。為了減少對細胞活動的影響，需盡量去模擬細胞體內的環(huán)境，如適宜的pH(5.6)、溫度(37℃)等。如茶葉中存在大量的多酚類物質，因此在該酶的分離提純過程中要加入多酚吸附劑，如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl　pyrrolidone，PVP)等以清除多酚。

　　多酚氧化酶的分離提純方法有冷丙酮法和勻漿法二種方法。須海榮 [23]研究指出：冷丙酮法效果較差，酶活較低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆變性有關，但其操作相對而言較為方便。隨著酶提取技術的發(fā)展，勻漿法逐步得以完善，首先它在酶的提取過程中能最大限度地保留酶的活性，其次能去除多酚氧化酶提取中的一些雜蛋白以及過氧化物酶等一些酶蛋白的影響。再采取硫酸銨分級沉淀，凝膠色譜等技術，以達到純化目的。

　　七、應用前景

　　調節(jié)PPO表達是未來研究熱點，一方面因為受傷或衰老會導致黑色素的形成，負調節(jié)PPO能大量提高作物的質量;另一方面PPO的過度表達能減少害蟲對作物的侵害，或通過影響植物蛋白形成抗營養(yǎng)機制，或在毛狀體滲出液中通過它啟動聚合作用捕獲昆蟲。因此負調節(jié)PPO表達或調節(jié)PPO使其過度表達在生產及應用方面都具有很好的前景及重要的實際意義。

        參考文獻

　　BhattacharyaM, Luo Q, and Corke, H. Time-dependent changes in dough color in hexaploid wheat landraces differing inpolyphenol oxidasea-ctivity[J].J.Agric. Food Chem,1999,(47).

　　李榮林，方輝遂.一個世紀以來對多酚氧化酶研究的進展[J].福建茶葉，1997，(4).

　　謝春艷，賓金華，陳兆平.多酚氧化酶及其生理功能[J].生物學通報.1999，34(6).

　　Steffens, J.C.,Hare,l andHunt,M.D. Polyphenol oxidase. Pages in:Genetic Engineering of Plant Secondary Metabolism[J].Plenum Press:New york, 1994.

　　Whitaker, J.R., and Lee,C.Y. Recent advances in chemistry of enzymatic browning: an overview. Enzymatic browning and Its Prevention[J].C.Y.Lee and J.R.Whitaker, eds.ACS:washing,DC,1995.

　　Newman, S. D,Eannetta,N. T.,Yu,H., Prince, et al.Orgaanizaation of the tomato polyphenol oxidase gene family[J].Plant Mol.1992,(21).

　　Thygesen, P.W.,Dry, I.B., and Robinson, S. P. Polyphenol oxidase in Potato.A multigene family that exhibits differential expression patterns[J].PlantPhysio.l 1995,(109).

　　Cary,J.W.,Lax,A.R., and Flurkey,W.H. Cloning and characterization of cDNAs coding forVicia faba polyphenol oxidase[J].PlantMo.l Bio.l 1992,(20).

　　Okot-Kotber,M.A.,Liavoga,A.,Yong,K. J,et al. Activity and inhibition ofpolyphenoloxidase in extracts of bran and othermilling fractions from a variety ofwheat cultivars[J].CrealChem. 2001,(78).

　　孫淑聲，等.無機化學[M].北京：北京大學出版社，1991.

　　賀立紅.高等植物中的多酚氧化酶[J].植物生理學通訊，2001，37(4).

　　[12]Yu H, Kowalski S P,Steffens J C .Comparison of polyphenol oxidase expressioning and dular trichomes of solanum and lycopersicon species[J].Plant Physiol,1992,100(4).

　　[13] Duffey S,Felton G .Enzymatic antinutritive defenses of the tomato plant against insects .In Hedin P(ed) .Natutally Ocurring Pest Bioregulators.Washington D C .American chemical Society ,1991.

　　[14]Thipyapong P ,Joel D M ,Steffens J C .Differential expression and turn over of the tomato polyphenol oxidase gene family during vegetative and reproductive development[J].Plant Physiol,1997,13(3).

　　[15] ZawistowskiJ,Biliaderis CG,Eskin NAM. polyphenol oxidase. In:Robinson DS, Skin NAME (eds). Oxidative Enzymes in Foods.London: Elsevier Science Publishers,1991.

　　[16]鐘瑾，蕭偉祥，蕭慧.紅茶色素形成機理和制取[J].茶葉科學，1997，17(1).

　　[17]李榮林，等.多酚氧化酶固定化技術[J].茶葉科學 ，1997，17(S1).

　　[18]李榮林.固定化多酚氧化酶的化學性質研究[J].茶葉，1998，24(1).

　　[19]王守生.茶樹多酚氧化酶活性比色測定中抑制劑的選擇和應用[J].茶葉通訊，1996，(1).

　　[20]Wrigley, C. W. Single-seed identification ofwheat varieties: use of grain hardness testing, electrophoretic analysis and a rapid testpaper for phenol reaction[J]. Sc.i Food Agric. 1976,(27).

　　[21]Kruger, J.E. Changes in the polyphenol oxidases ofwheatduring kernel growth andmaturation[J].erealChem. 1976,(53).

　　[22]Anderson, J.V. and C.F.Morris.An improved whole-seed assay for screen-ingwheatgermplasm for polyphenol oxidase activity[J].Crop Sc.i 2001,(41).

　　[23]須海榮.浙江12個茶樹良種酯酶同工酶譜聚類分析[J].茶葉科學，1988，8(2).

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