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肝細胞生長因子對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖影響的實驗研究論文
目的 觀察肝細胞生長因子（HGF）對子宮內(nèi)膜癌細胞HEC?2B增殖的影響及子宮內(nèi)膜癌細胞HEC?2B中HGF受體C?met的表達，了解HGF對子宮內(nèi)膜癌細胞的作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC?2B，用RT?PCR的方法檢測HEC?2B中HGF受體C?met有表達。對HEC?2B進行24 h血清饑餓后用不同劑量的HGF作用于HEC?2B。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)分析細胞的增殖力，用流式細胞儀檢測細胞的增殖周期。結(jié)果 C?met在HEC?2B細胞中穩(wěn)定表達，HGF促進細胞的增殖，并在一定的范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系，各處理組與對照組相比，P<0.05。當(dāng)HGF濃度達到60 ng· mL-1時，增殖水平較對照上調(diào)約1.9倍。結(jié)論 HGF/C?met能夠在體外促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor C?met and understand the molecular mechanism. Methods Endometrial cancer cell line, HEC?2B was cultured in vitro. The expression level of C?met in HEC?2B was determined with RT?PCR. HEC?2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical evaluations were conducted using t?test. Results C?met was expressed in HEC?2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC?2B in a dose?dependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion C?met was expressed stably in HEC?2B cells. HGF/C?met system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.
Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor
子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，近20年來在世界范圍內(nèi)子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率有上升趨勢。肝細胞生長因子(HGF)是一個多功能生長因子。HGF的單一受體C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met編碼。在許多惡性腫瘤中C?met被過表達［1-6］。HGF/C?met與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系卻鮮有報道。本研究通過觀察子宮內(nèi)膜癌細胞中C?met的表達及HGF對子宮內(nèi)膜癌細胞的作用，旨在為臨床以HGF／C?met為靶點治療子宮內(nèi)膜癌提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試劑與細胞株
子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC?2,購自中科院細胞庫;RNase、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript Ⅲ為Invitrogen公司產(chǎn)品;優(yōu)質(zhì)胎牛血清，Gibco公司;HGF購自R&D， Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix購自ABI公司。EPICS AL TRA流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司提供。
1.2 HEC?2B細胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)
將細胞以1×105/cm2接種于細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5 mL含10%(φ)FBS（胎牛血清）的DMEM；培養(yǎng)24 h后，換5%FBS的DMEM饑餓培養(yǎng)12 h，分別加入濃度為20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF進行處理，設(shè)置空白組不進行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中FBS的濃度改成5%；培養(yǎng)48 h后收集細胞。
1.3 PCR
用PBS清洗細胞，用Trizol法抽提RNA，并常規(guī)檢測RNA的純度及完整性。反轉(zhuǎn)錄，用人的β?actin基因檢測反轉(zhuǎn)錄是否成功。PCR條件為：94 ℃ 5 min 激活聚合酶，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃45 s，共33循環(huán)，72 ℃保溫10 min，4 ℃保溫10 min。采用瓊脂糖凝膠檢測的方法進一步驗證。Realtime定量PCR條件為：95 ℃ 5 min 激活聚合酶，95 ℃變性15 s，57 ℃退火5 s，72 ℃ 25 s，共45循環(huán)。采用ABI7300系統(tǒng)進行檢測，每個循環(huán)結(jié)束檢測熒光強度。融解曲線分析：每分鐘讀1次，檢測范圍為55 ℃ 到 95 ℃。熒光強度檢測采用動態(tài)跟蹤的方法，自動測出Ct值（每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），用2?△△Ct 表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)，并采用瓊脂糖凝膠檢測的方法進一步驗證。Β?actin引物序列如下：上游引物 5′?gctct tttcc agcct tcctt?3′,下游引物 5′? tgatc cacat ctgct ggaag?3′。C?met檢測引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′ 。C?met檢測引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′,產(chǎn)物大小300 bp。
1.4 用MTT法檢測細胞增殖能力
取對數(shù)生長期的細胞，用含0.25%(φ)胰酶消化，懸浮于適量培養(yǎng)基中，通過細胞計數(shù)將其濃度調(diào)整到4×104個細胞/mL。將此細胞懸液以100 μL/孔均勻接種到細胞培養(yǎng)板上，置于37 ℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，換成稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞饑餓。分組加藥，分別將含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培養(yǎng)液100 μL加入細胞培養(yǎng)孔中，每個稀釋度做4個復(fù)孔，設(shè)立空白對照組。加樣后置于37 ℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)44 h，每孔加入20 μL MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，加入抽提液150 μL/孔，置于微量振蕩器張充分振勻以抽取染料，振動15 min。以570 nm為檢測波長，630 nm為參考波長，用酶標儀測定各孔的吸光值（A）
1.5 流式細胞檢測
消化并收集細胞，每檢測管中(0.5～1)×106細胞，PBS清洗一遍，離心去上清，轉(zhuǎn)速1 000 r/ min，5 min，沿管壁緩慢加入終濃度70％(φ)的乙醇，混勻，－20 ℃ 固定過夜，1 000 r/min 離心5 min去上清，PBS清洗一遍，加入Rnase抑制劑50 μL，加入50 μg/mL的PI染料混勻，4 ℃ 避光30 min，上機檢測。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法
采用t檢驗，P<0.05 為差異有顯著性。
2 結(jié) 果
2．1 HEC?2B的培養(yǎng)與傳代
HEC?2B為起源于子宮內(nèi)膜癌的細胞系，在10% 胎牛血清( Fetal Calf Serum, FCS)，DMEM培養(yǎng)基，5％ CO2，37℃的培養(yǎng)條件下，細胞生長良好，其形態(tài)見圖1所示。
將上述總RNA逆轉(zhuǎn)錄后，采用PCR的方法進行擴增，電泳后進行EB染色（圖3），發(fā)現(xiàn)得到條帶的大小與預(yù)計的300 bp相符合，表明在HEC?2B細胞中具有C?met基因的轉(zhuǎn)錄。
經(jīng)反復(fù)后傳5、10、15、20、25代后，抽提總RNA，各樣品之間RNA的量相近，C?met的轉(zhuǎn)錄水平基本維持不變。各組之間比較，P>0.05,差異無顯著性。結(jié)果見圖4、表1所示。
表1 RT?PCR測得C?met表達水平（略）
2．3 HGF對HEC?2B的影響
2．3.1 MTT法檢測結(jié)果
20 ng· mL-1的HGF即能夠明顯促進HEC?2B的增殖，并表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系，當(dāng)HGF濃度達到60 ng·mL-1時，增殖水平較對照上調(diào)約1.9倍，此后有所下降，100 ng·mL-1的HGF仍能夠明顯促進HEC?2B的增殖（圖5）。
2．3.2 流式細胞檢測結(jié)果
用20 ng·mL-1HGF處理HECT?2B細胞，即可使處于G1細胞比例減少，處于G2+S期細胞增多，當(dāng)HGF濃度增加到60 ng·mL-1時，G1期細胞最少，G2+S期細胞最多。增殖指數(shù)（proliferation index, PI）可以用來反映細胞的增殖狀況，各濃度的HGF處理組都可以明顯促進HECT?2B細胞的增殖。結(jié)果見圖6與表2所示。表2 HGF處理對HEC?2B細胞增殖周期的影響（略）
3 討 論
肝細胞生長因子(HGF)首先從部分肝臟切除的大鼠的血清中提取，由于其對肝細胞具有強的絲裂原作用，因此命名為肝細胞生長因子［7］。HGF的單一受體C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met編碼［5］。許多文獻報道C?met在較多腫瘤中都有較高表達，這些腫瘤包括：卵巢癌［1］、腎癌［2］、膀胱癌［3］、乳腺癌［4］、胰腺癌［5］與前列腺癌［6］。但HGF/C?met在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中所起作用卻鮮有報導(dǎo)。
正常細胞的生長過程是一種有控生長，且會逐步分化；腫瘤細胞則生長失控化，幼稚化。腫瘤細胞體的不穩(wěn)定性和非整倍體細胞的出現(xiàn)即是由這種細胞周期調(diào)節(jié)機制失控所造成的［7］。這種失控也使腫瘤細胞在傳代時可能發(fā)生一些自發(fā)的重組而導(dǎo)致一些基因的啟動子丟失，使這些基因不表達或表達量減少。本實驗檢測了HEC?2B細胞中C?met的表達情況，發(fā)現(xiàn)C?met的mRNA能夠持續(xù)存在于HEC?2B細胞中。在體外持續(xù)的傳代多達25次，仍能夠檢測到C?met的mRNA，而且數(shù)量沒有明顯的變化，充分說明在很長的時間范圍內(nèi)，C?met的啟動子能夠被持續(xù)穩(wěn)定地激活，說明該基因表達對HEC?2B具有較為重要的生理或病理學(xué)意義。 本實驗結(jié)果表明：MTT及流式細胞儀的結(jié)果均顯示：20 ng·mL-1的HGF促進HEC?2B的增殖，當(dāng)HGF濃度達到60 ng·mL-1時，促增殖作用最強，此后作用稍減弱，HGF濃度達到100 ng·mL-1時仍有一定促增殖作用，在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系�？紤]與HGF是通過與受體結(jié)合來起作用有關(guān)：當(dāng)HGF與受體結(jié)合未達到飽和時，促增殖作用隨HGF濃度的增加而增強；當(dāng)與受體結(jié)合達飽和時，增殖作用便不呈現(xiàn)劑量依賴性。內(nèi)膜癌細胞中有C?met的表達，HGF能有效促進內(nèi)膜癌細胞增殖。在體內(nèi)，HGF是否與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，問題的關(guān)鍵在于體內(nèi)是否存在HGF直接作用于子宮內(nèi)膜癌組織的可能性。
研究表明，在體內(nèi)HGF可由子宮內(nèi)膜上皮下層的基質(zhì)細胞來分泌表達［8］ 。 HGF對子宮內(nèi)膜上皮細胞的作用是以旁分泌的方式進行的。這樣就給子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展提供了營養(yǎng)支持。Yoshida等［9］認為，腫瘤細胞能夠分泌堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，而基質(zhì)細胞膜上有bFGF的受體，一旦與配體結(jié)合后，即能夠促進HGF的表達上調(diào)，反過來促進腫瘤細胞的生長。
本研究提示，HGF/C?met能夠在體外促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與增殖。研究發(fā)現(xiàn)C?met是一個極有希望的治療靶點，一些HGF的拮抗劑已進入治療腫瘤的實驗階段［10］。這一結(jié)果為通過阻斷 HGF/C?met系統(tǒng)的表達或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療內(nèi)膜癌提供了新思路。
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