冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究進展

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　　【摘要】 冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA-binding protein，CIRP)是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，伴隨紫外線照射、冷應(yīng)激及缺氧等過程而過量表達。研究證實，CIRP無論是在核酸結(jié)構(gòu)上，還是在氨基酸結(jié)構(gòu)上都是高度保守，具有較高的同源性，其細胞定位和生理功能可能具有組織特異性;CIRP不僅具有介導(dǎo)冷誘導(dǎo)的細胞生長抑制作用，而且可能參與人和動物紫外線照射應(yīng)激、缺氧應(yīng)激、腫瘤發(fā)生，以及腫瘤抑制等多種生理病理過程。因此，深入開展CIRP的功能性研究和應(yīng)用性研究具有重要的基礎(chǔ)研究價值和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

　　【關(guān)鍵詞】 冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白;應(yīng)激反應(yīng);腫瘤

　　低溫對細胞的作用包括：降低細胞的耗氧量和代謝率，調(diào)節(jié)氧化還原和改變基因的表達[1、2]。低溫冷適應(yīng)的分子機制，尤其對哺乳動物細胞，目前了解得很少。對寒冷的反應(yīng)包括：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞骨架、細胞周期和代謝等過程[3、4]。許多研究發(fā)現(xiàn)，細胞處在亞低溫(32℃)時，即使只有一瞬間，其內(nèi)部所發(fā)生的變化遠比我們目前已了解得要多得多。一旦機體暴露在低溫環(huán)境下，特定的冷休克蛋白立即做出反應(yīng)，確保細胞或機體能快速的適應(yīng)環(huán)境。雖然在過去的十幾年里大量的冷休克蛋白被發(fā)現(xiàn)，但是迄今為止僅有兩種被較好的定性：即冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)和RNA結(jié)合基礎(chǔ)蛋白3[5]。本文就CIRP做一個綜述。

　　1CIRP的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)

　　CIRP最早是在轉(zhuǎn)錄的研究中被發(fā)現(xiàn)，當紫外線(UV)或與UV相似的藥物損傷DAN時，CIRP即被誘導(dǎo)產(chǎn)生，且以UV劑量依賴的方式增加[6]。后來發(fā)現(xiàn)在亞低溫狀態(tài)下，CIRP亦出現(xiàn)高表達[6]。Xue等通過體外細胞培養(yǎng)，在冷應(yīng)激1~3h后探測到CIRP，在12h表達最高，意味著CIRP是在亞低溫環(huán)境中最早的應(yīng)激產(chǎn)物之一。CIRP在成年老鼠的睪丸、肺、心臟、腎、海馬和大腦皮質(zhì)中持續(xù)表達[7]。在雄性生殖細胞中CIRP水平根據(jù)不同發(fā)育階段而改變[8]。CIRP位于染色體19p13.3位點上，CIRP蛋白含有172個氨基酸，兩個確定的區(qū)域。第一個是RNA結(jié)合區(qū)域(RMM motif)，它在不同物種及與RNA結(jié)合中高度保守。RRM是被充分鑒定的RNA結(jié)合基序之一，大約由90個氨基酸構(gòu)成，包含兩個高度保守序列(一個為八聚體，另一個為六聚體)，分別被定名為核糖核蛋白1(ribonucleoprotein1，RNP1)和核糖核蛋白2(RNP2)，還含有許多其他的保守性氨基酸(多數(shù)為疏水性氨基酸)。第二是富含甘氨酸的區(qū)域(RGG motif)，功能目前尚不明確。

　　2CIRP與應(yīng)激反應(yīng)

　　絕大多數(shù)真核細胞mRNAs(~90%)是通過帽子依賴(cap-dependent)機制進行翻譯。而這個翻譯機制在應(yīng)激狀態(tài)時受到抑制，由內(nèi)部核糖體進入位點(IRES，internal ribosome entry site)(約占細胞mRNAs的10%)機制代替帽子依賴機制進行翻譯[9]。研究證實cirp在亞低溫等應(yīng)激環(huán)境中，其轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)最完整，顯示強大的IRES活性[10]。CIRP常常蓄積在一些應(yīng)急顆粒中(應(yīng)急顆粒是細胞代謝時期在翻譯過程中沉默的mRNAs累積的地方)，能調(diào)控和聚合特殊mRNAs進入應(yīng)急顆粒[11、12]。CIRP的核質(zhì)分布由它C末端區(qū)域的甲基化來控制[11]。在低溫、UV照射、缺氧等應(yīng)激條件下CIRP表達增加，從細胞核轉(zhuǎn)移到胞漿，和有限的幾種RNA(包括幾個應(yīng)急誘導(dǎo)分子)相結(jié)合，參與DNA損傷的修復(fù)、轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)和增加蛋白質(zhì)的翻譯[13]，起到細胞保護作用[14、15]，被認為是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白�？梢酝茰y在應(yīng)激狀況下，CIRP在細胞內(nèi)的位置可能對mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯起到?jīng)Q定性的作用。在UV應(yīng)激反應(yīng)的模型中，通過直接干預(yù)CIRPmRNAs的3'-UTR，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個CIRP的作用靶點[13]。CIRP特異性地結(jié)合到復(fù)制蛋白A(the replication protein A，RPA2)和硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)mRNAs的3'-UTR上。RPA2和TRX是兩種能增加細胞或機體對應(yīng)激反應(yīng)適應(yīng)性能力的蛋白[16、17]。TRX是一種普遍存在的多功能的蛋白，它通過清除(quenching)氧自由基調(diào)節(jié)細胞信號[18]。而RPA2是腫瘤克隆增生的指標，是腫瘤治療的靶點[19]。除了因UV照射后應(yīng)急和低氧而產(chǎn)生的翻譯后修飾如甲基化以外，CIRP也被GSK3β激酶磷酸化而轉(zhuǎn)移到細胞漿，和TRX轉(zhuǎn)錄物結(jié)合并通過與整個轉(zhuǎn)錄相互作用而增加翻譯[20]。在不同的應(yīng)急狀態(tài)中，影響CIRP磷酸化的激酶應(yīng)需要進一步研究，從而能了解這些基因的功能。另外，亞低溫的腦保護作用已被肯定，CIRP是否扮演了積極的角色呢?這需要進一步研究。

　　3CIRP對腫瘤的作用

　　在美國或西歐，每4個人中就有1個可能患癌癥。從病理和臨床觀點看，致癌過程和下面幾個系列事情發(fā)生：(1)不能被滅活;(2)轉(zhuǎn)化;(3)侵入;(4)轉(zhuǎn)移。多細胞器官已經(jīng)形成一些機制去避免細胞增殖過程中的無限的增長和惡變。機制之一是復(fù)制的衰竭，即當致癌變化出現(xiàn)時能及時被阻止[21]。從動物組織中直接得到的原始細胞能在體外移植，在不同的環(huán)境中培養(yǎng)和分化。原始細胞的主要特征是：在出現(xiàn)復(fù)制衰竭前具有分化成幾種不同細胞的能力。復(fù)制衰竭的特征：顯示某種表型如巨細胞形態(tài)、β-牛乳糖的活性，和基因型的變化如PAI-1的過表達以及細胞周期抑制蛋白的上調(diào)如p21，p16或p19[22]。因此，細胞如果想要避免衰竭，就需要發(fā)生內(nèi)在或外在的變化。早期認為復(fù)制衰竭是組織培養(yǎng)應(yīng)激的結(jié)果，但是有趣的是在良性病變的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了衰竭的細胞[23]。實際上，惡性腫瘤并沒有衰竭細胞，可能是因為這些細胞已經(jīng)經(jīng)歷了突變，而具有致癌的性質(zhì)。運用高通量復(fù)合遺傳篩選法，發(fā)現(xiàn)CIRP的過表達增加了P-ERK 1/2的水平，影響了一些蛋白質(zhì)(和翻譯起始有關(guān)的蛋白質(zhì)，如4EB-P1、S6)的磷酸化，而讓鼠原始細胞得以避免出現(xiàn)衰竭[24]。同時也發(fā)現(xiàn)CIRP在抑制細胞凋亡中亦起到重要的作用[25]。在一個有193例患者的隊列研究中發(fā)現(xiàn)，CIRP在幾種人類腫瘤中是高表達的[24]。而在本院腫瘤隊列研究中，筆者在細胞漿中發(fā)現(xiàn)了CIRP;然而，我們不能確定CIRP的位置能否在腫瘤發(fā)生中調(diào)節(jié)它的功能。CIRP在33%的克隆性增生中和45%的乳腺癌患者中過表達的事實支持它參與了腫瘤的生長[5]。除了發(fā)現(xiàn)CIRP能作為新的致癌蛋白之外，在近期的一些研究中也發(fā)現(xiàn)了它的抗癌作用。曾等闡述了CIRP可減少前列腺細胞(LNCaP and PC-3)的增生，更重要的是，CIRP敲除不僅傷害到細胞的生存，還增強細胞對順鉑和阿霉素的化學(xué)敏感性，這都顯示CIRP可能是治療前列腺癌新的藥物[26]。CIRP抑制同時也損害到其他細胞系(如HeLa，TERA2)的增生，顯示它也可應(yīng)用于其他癌癥的治療。

　　4CIRP抗衰竭的作用

　　衰竭與抗衰竭的關(guān)鍵調(diào)控通路包括：細胞周期蛋白pRB和p53，致癌基因的高表達(如c-myc)，端粒酶的持續(xù)性，表觀遺傳學(xué)調(diào)控，小RNA分子的調(diào)節(jié)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等等[27、28]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞衰竭早已得到證實，而抗氧化酶在對抗ROS的作用同時，還能使原始細胞避免衰竭并增生。例如，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase enzyme，SOD)抗衰竭的能力在許多不同的細胞和組織中已經(jīng)被研究。SOD表達增加能延長初級成纖維細胞的生命[29];相反，SOD敲除誘發(fā)細胞早期出現(xiàn)衰竭[30]，還有就是TRX的抗衰老的作用，實驗已經(jīng)證實TRX表達的轉(zhuǎn)基因鼠顯示了一個中等的但有意義的生命的延長[31]。研究證實CIRP，除了使特殊的mRNAs和翻譯機制中必須的蛋白活化外，還可能激活一些mRNAs(能編碼參與清除ROS的蛋白，如抗氧化酶TRX)。Lleonart等[5]提出了CIRP抗衰竭通道模型，并得到如下事實所支持：(1)CIRP表達水平下降的細胞比CIRP表達正常的細胞對UV照射更敏感，眾所周知，UV是主要的ROS誘導(dǎo)物[13];(2)當UV照射時，CIRP被激活并引起TRX的表達[20];(3)缺氧是產(chǎn)生ROS的一個機制，同時也激活CIRP;(4)CIRP刺激基礎(chǔ)翻譯機制中成分(如eIF4G，4E-BP1和S6)或與它們相互作用，促進翻譯[20、24]。另外，CIRP在缺氧時的高表達能增加mRNA和蛋白的水平和參與細胞增生這個事實說明他可能參與了新生血管的形成。這很容易讓人去假設(shè)，CIRP的上調(diào)(在大量的癌癥中可觀察到[24、32])是腫瘤對缺氧做出的反應(yīng)。下面的事實支持這個觀點：(1)缺氧時該蛋白受到刺激;(2)CIRP高表達增加VEGF蛋白的水平，VEGF是重要的血管生成刺激蛋白;(3)缺氧誘導(dǎo)的GSK3β激酶使CIRP磷酸化，使CIRP的結(jié)合力增加[25]。此外，CIRP激活的抗氧化酶能使ROS的毒害作用減少的可能性也是一個很有吸引力的假設(shè)，可以解釋，至少在部分上，CIRP高表達的細胞能抵抗UV照射產(chǎn)生的毒副作用[13]。5結(jié)論本文章闡述了這個事實，作為可能的致癌蛋白，CIRP在高表達時有以下特征：(1)增加蛋白合成的能力;(2)直接或間接參與腫瘤發(fā)生;(3)參與原始細胞的抗衰竭功能;(4)腫瘤惡化中的高表達。 CIRP抗衰竭的能力，可能和它保護細胞免受ROS蓄積的毒害的作用密切相關(guān)。因此，我們認為探索在冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白的活性下詳盡的分子調(diào)節(jié)機制是非常重要的，因為在幾個人體病理特性中，包括腫瘤的發(fā)生，它的功能可能和拓寬生理及生物進程密切相關(guān)。

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