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枸杞多糖對大鼠腰椎間盤退變影響的形態(tài)學(xué)
枸杞多糖對大鼠腰椎間盤退變影響的形態(tài)學(xué)
【摘要】 目的 探討枸杞多糖(LBP)對大鼠退變腰椎間盤的形態(tài)學(xué)的影響。
方法 將健康雄性SD大鼠42只，隨機分為假手術(shù)組、椎間盤退變組、LBP干預(yù)組，每組14只。
采用手術(shù)方法制作大鼠腰椎間盤退變模型，LBP干預(yù)組在造模后4周，每天上午8：00灌胃給藥，80mg?mL-1，容量為1mL?kg-1，連續(xù)4周。
假手術(shù)組及椎間盤退變組分別給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。
在造模后8周三組所有大鼠再次麻醉，取出椎間盤組織，分別在光鏡及電鏡下觀察椎間盤形態(tài)學(xué)的變化。
結(jié)果 HE染色光鏡觀察假手術(shù)組髓核細胞豐富，形態(tài)不規(guī)則，集中成簇;椎間盤退變組髓核細胞稀少，細胞基質(zhì)見大量的空泡;LBP干預(yù)組髓核細胞有變性、壞死，但較椎間盤退變組退變程度減輕。
電鏡下假手術(shù)組的髓核細胞多見，核膜完整，細胞器豐富;椎間盤退變組髓核細胞減少，細胞器缺失，見大量的空泡;LBP干預(yù)組髓核細胞減少，有變性、壞死，退變較椎間盤退變組減輕。
結(jié)論 LBP可能對大鼠腰椎間盤髓核組織退變有延緩作用。
【關(guān)鍵詞】 腰椎間盤;退變;枸杞多糖
腰椎間盤退行性變(Intervertebral Disc Degeneration，IVDD)是導(dǎo)致下腰痛和神經(jīng)痛的主要原因[1-2]。
椎間盤退變是個復(fù)雜的病理過程，引起退變的確切原因尚不清楚。
目前研究的關(guān)注點在于如何尋找有效的藥物或生物制劑抑制細胞因子或炎癥介質(zhì)，從而延緩或抑制椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展。
實驗證實[3-4]椎間盤退變表現(xiàn)為一系列組織形態(tài)學(xué)上的變化。
觀察用藥后椎間盤組織形態(tài)學(xué)的變化，可驗證藥物或生物制劑對椎間盤組織的作用。
本實驗采用枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)作為干預(yù)劑作用于腰椎間盤組織退變的大鼠，并通過組織形態(tài)學(xué)的觀察以驗證其對椎間盤退變組織的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選取雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠42只，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重400～476g，動物合格證號：SCXK(寧)2005-0001。
1.2 藥品及試劑
LBP溶液(寧夏啟元藥業(yè)公司生產(chǎn)的粉劑，批號：GF03002-l，純度58.56%)，使用前用生理鹽水配制80mg?mL-1新鮮溶液。
1.3 方法
1.3.1 實驗動物分組
隨機將大鼠分為假手術(shù)組(14只)、椎間盤退變組(14只)和LBP藥物干預(yù)組(14只)。
1.3.2 大鼠腰椎間盤退變造模
采用陳德勝等[5]建立大鼠腰椎間盤退變模型的方法，以6.5%的水合氯醛(購于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑中心)0.055mL?kg-1腹腔注射麻醉SD大鼠無菌條件下沿腰背部棘突做后正中切口，切開皮膚后，沿骨膜下剝離，充分顯露L1～6棘突、關(guān)節(jié)突及椎板。
咬骨鉗去除棘突、關(guān)節(jié)突、棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎棘肌，依層縫合皮下筋膜、皮膚。
假手術(shù)組SD大鼠僅切開皮膚后即縫合。
1.3.3 LBP藥物干預(yù)方法
LBP藥物干預(yù)組在造模后4周，每天上午8：00灌胃給藥，容量為1mL?kg-1，連續(xù)4周。
假手術(shù)組及椎間盤退變組分別灌胃給予等容量生理鹽水，連續(xù)4周。
在大鼠腰椎間盤退變模型建立8周后三組所有大鼠再次麻醉，顯露腰椎間盤，迅速取出L3～4或L4～5椎間盤組織。
1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察
三組大鼠椎間盤組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，脫水、石蠟包埋、組織切片(厚4～5μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察椎間盤髓核組織的形態(tài)學(xué)變化。
1.5 電子顯微鏡下觀察
迅速將切除的椎間盤組織先置于2%戊二醛溶液固定，2 h后，待髓核的蛋白組織徹底變性、凝固后再切取髓核組織，0.1M二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次，每次間隔2 h之后固定過夜。
1%鋨酸固定，乙醇、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂812包埋，超薄切片經(jīng)檸檬酸鉛染色后，在日立H-600型透射式電子顯微鏡下觀察并攝片。
2 結(jié)果
2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果
2.1.1 假手術(shù)組
可見較多的髓核細胞和不定型的基質(zhì)，細胞形態(tài)不規(guī)則集中成簇，細胞質(zhì)染色深，細胞外的基質(zhì)豐富，細胞周圍含水量較明顯，膠原纖維排列整齊，見圖1-A(封2)。
2.1.2 椎間盤退變組
髓核細胞數(shù)目減少，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，細胞周圍基質(zhì)較多，細胞含水量減少，同時出現(xiàn)大量的空泡，膠原纖維環(huán)排列紊亂，見圖1-B(封2)。
2.1.3 LBP藥物干預(yù)組
髓核細胞出現(xiàn)不同程度的數(shù)目減少和形態(tài)變化，髓核細胞有變形、壞死 ，見圖1-C(封2)。
與椎間盤退變組相比，髓核細胞數(shù)目及細胞外基質(zhì)較多，空泡數(shù)目較少。
2.2 電子顯微鏡下觀察結(jié)果
2.2.1 假手術(shù)組
髓核細胞有突起，細胞核多呈卵圓形或圓形，核膜完整，染色體位于細胞核中央。
細胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多并排列整齊，可見生長良好的線粒體和高爾基體，細胞漿內(nèi)有大量的糖原顆粒，見圖2-A(封2)。
2.2.2 椎間盤退變組
可見壞死的髓核細胞，死亡的細胞外周出現(xiàn)增厚的組織，密度較高。
少見的髓核細胞出現(xiàn)空泡變性，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，核膜不完整，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器稀少。
粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體空泡狀，線粒體腫脹、崩裂或空泡化。
嚴重者細胞器分辨不清，胞漿基質(zhì)密度加深、整個細胞體積縮小。
有的細胞呈凋亡改變，胞質(zhì)模糊不清，胞膜不完整或缺如。
細胞質(zhì)內(nèi)被大量的空泡填充，見圖2-B(封2)，部分細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡改變。
2.2.3 LBP藥物干預(yù)組
髓核細胞可見突起和皺褶，體積雖有縮小但大于造模組，細胞核有變形，染色質(zhì)出現(xiàn)排列異常，但形態(tài)較規(guī)則。
細胞器依稀可見，有的模糊不清，胞膜欠完整。
有的可見細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體，但線粒體內(nèi)嵴樣結(jié)構(gòu)觀察欠清晰。
細胞質(zhì)電子密度低的空泡明顯少于椎間盤退變組，見圖2-C(封2)。
3 討論
隨著我國老齡化社會的到來，機體退變性的病變?nèi)缱甸g盤退變引起的脊柱疾患日益構(gòu)成對人民健康的威脅，并嚴重影響其生活質(zhì)量。
采取有效的藥物或生物制劑延緩或抑制椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展一直是近年來脊柱外科研究的熱點。
椎間盤髓核細胞及纖維環(huán)在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性及修復(fù)椎間盤退變的過程中起著至關(guān)重要的作用[6]。
本實驗的大鼠椎間盤退變模型是通過改變脊柱生物力學(xué)，使得椎間盤穩(wěn)定性失衡，從而椎間盤出現(xiàn)退行性改變。
椎間盤的組織形態(tài)學(xué)改變與椎間盤退變發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
實驗證實：椎間盤退變表現(xiàn)為一系列組織形態(tài)學(xué)上的變化[3-4]。
光學(xué)顯微鏡下觀察，正常的椎間盤組織可見髓核細胞分布在髓核中，細胞增殖活躍，膠原纖維排列整齊。
隨著年齡的增長發(fā)生漸進性的退行性改變，表現(xiàn)為細胞減少，組織結(jié)構(gòu)紊亂的程度逐漸加重，膠原纖維增生、粗大、走行紊亂[7]。
本實驗研究的假手術(shù)組、可見較多的髓核細胞和不定型的基質(zhì)，細胞形態(tài)不規(guī)則集中成簇，細胞外的基質(zhì)豐富，膠原纖維排列整齊。
而椎間盤退變組與上述正常椎間盤組織形態(tài)和椎間盤自然退變的形態(tài)學(xué)變化相符合。
LBP藥物干預(yù)組為髓核細胞出現(xiàn)不同程度的數(shù)目減少和形態(tài)變化，髓核細胞有變形、壞死。
此組光學(xué)顯微鏡下的病理改變介于上二組之間，說明LBP可能對椎間盤退變有延緩作用。
從根本上而言，退變椎間盤的變化在于自身細胞的功能退化、凋亡和壞死。
通過超微結(jié)構(gòu)的觀察，以明確椎間盤退變發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)程度。
正常的椎間盤組織超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為髓核細胞胞膜外有突起，核膜完整，染色體位于細胞核中央。
細胞質(zhì)的細胞器表現(xiàn)為大量密集的呈扁平囊狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其間的一些多聚核糖體和單個核糖體。
線粒體數(shù)量多，呈板狀或管狀嵴。
膠原纖維在正常間盤排列緊密，呈波浪狀。
而發(fā)生退變的椎間盤會出現(xiàn)相應(yīng)的變化。
劉勇等[8]電鏡下觀察突出椎間盤組織，發(fā)現(xiàn)細胞胞質(zhì)中的線粒體數(shù)量少或看不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，嚴重退變細胞中溶酶體、空泡和微絲增多，壞死細胞中細胞器空化。
這些都是細胞功能衰退的征象，并與退變的程度相關(guān)。
Helen等[9]電鏡下觀察不同年齡階段椎間盤膠原纖維的波紋發(fā)現(xiàn)，膠原纖維在正常間盤排列緊密，呈波浪狀，而在退變間盤中排列稀疏和折皺。
本實驗電子顯微鏡下觀察結(jié)果與上述文獻報道比較吻合，證實了通過手術(shù)方法建立的大鼠腰椎間盤退變模型[5]椎間盤超微結(jié)構(gòu)的改變與椎間盤退變程度相關(guān)。
LBP藥物干預(yù)組為髓核細胞出現(xiàn)不同程度的數(shù)目減少和形態(tài)變化，髓核細胞有變形、壞死。
此組超微結(jié)構(gòu)的病理改變介于假手術(shù)組和椎間盤退變組之間，進一步驗證了LBP可能具有延緩椎間盤退變的作用。
本文通過光鏡和電鏡觀察了LBP對大鼠退變的椎間盤髓核組織形態(tài)學(xué)的影響，驗證了LBP可能有延緩或抑制椎間盤退變的作用，為尋找預(yù)防、治療椎間盤退變的藥物提供了實驗依據(jù)。
【參考文獻】
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