醫(yī)學專業(yè)研究白血病課題畢業(yè)論文

　　1 材料

　　白花蛇舌草由江西藥都樟樹中藥飲片有限公司生產，批號20080701。將白花蛇舌草高速粉碎成碎片狀，浸泡于盛有10倍量藥材的蒸餾水的圓底燒瓶中12 h后，煎煮3次，收集濾液進行抽濾濃縮，將濃縮液置于旋轉蒸發(fā)器中，濾液蒸發(fā)成粉末，再將粉末準確稱重并溶于三蒸水，濾過除菌，配成濃度為220 mg/ml的白花蛇舌草水提液備用。噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品，RPMI1640為Gibco公司產品，小牛血清（FBS）為杭州四季青生產，凋亡檢測試劑盒為北京保賽生物技術有限公司生產。

　　2 方法

　　2.1 細胞培養(yǎng)白血病CEM細胞株本實驗室保存。培養(yǎng)基為含體積分數(shù)為10%的FBS的RPMI1640，并加入雙抗（青霉素100 U/ml和鏈霉素100μg/ml）。在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱（Therno Forma公司產品）中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

　　2.2 MTT比色實驗將CEM細胞懸液離心（1 500 r/min、8 min），臺朌藍拒染法進行細胞計數(shù)，調整細胞終濃度為3×105/ml進行實驗，將細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔190 μl，24 h后，實驗組分別加入6種不同濃度的白花蛇舌草溶液（終濃度分別為0.005 12，0.025 6，0.128，0.64，3.2，16 μg/ml）10 μl，對照組不加藥，微振蕩，另設空白組（只有培養(yǎng)基，無細胞）每組6個復孔，培養(yǎng)于3個時間段（24，48，72 h）后，每孔加MTT（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心（1 500 r/min、8 min），棄上清液，每孔加DMSO 150 μl，避光微振蕩，讓甲臜溶解充分，置于自動酶標儀，測490 nm處的吸光度（A490）值。抑制率（%）=［（對照組A值-實驗組A值）/對照組A值］×100%。

　　2.3 形態(tài)學觀察白花蛇舌草作用于CEM細胞時間和濃度同MTT比色實驗，在倒置顯微鏡下觀察實驗組和對照組CEM細胞的一般情況并照像；CEM細胞懸液離心涂片，Giemsa染色，油鏡下觀察細胞形態(tài)；取白花蛇舌草3個濃度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml）作用于CEM細胞，兩個時間段（24，48 h）后，制成超薄切片，在透視電鏡下觀察細胞超微結構及凋亡小體。

　　2.4 流式細胞術（FCM）分析白花蛇舌草3個濃度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml），作用于CEM細胞兩個時間段（24，48 h）后，細胞用PBS洗兩遍，70%乙醇固定，重懸于PBS中調整細胞濃度為1×106/ml，取100 μl，加碘化吡啶（PI）1 ml，輕輕混勻置4℃冰箱30 min，上機檢測（流式儀為 BECTON DTCKINSON，B.D公司產品），采用CenQuest軟件上機獲取10 000個細胞，ModFitlt軟件分析并統(tǒng)計結果。

　　3 結果

　　白花蛇舌草對白血病CEM細胞生長的影響不同時間和劑量白花蛇舌草對CEM細胞生長的影響見表1。0.025 6 μg/ml的白花蛇舌草即可顯著抑制CEM細胞生長，半數(shù)抑制濃度（IC50）約為0.128 μg/ml，從表1可見，白花蛇舌草對CEM細胞的抑制作用具有時間和劑量依賴性，抑制率隨劑量增高、時間延長而增大。

　　本實驗結果顯示，白花蛇舌草處理白血病CEM細胞后，能顯著抑制其生長。抑制率具有時間和劑量依賴性，隨著作用時間的延長，藥物劑量的增大，抑制率逐步提高。光鏡顯示，細胞體積縮小，核濃染，細胞數(shù)量與對照組比較大為減少。電鏡證明，形態(tài)學呈現(xiàn)典型的凋亡特征性改變，核染色質凝集，沿核膜周邊聚集呈新月形，胞膜內陷包裹變性的細胞內容物成凋亡小體，這些變化是確認細胞凋亡的十分可靠的方法［5］。流式細胞術進一步說明白花蛇舌草能誘導CEM細胞凋亡。

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